Cromatografia líquida
A cromatografia é uma das ferramentas mais poderosas em química analítica e é um dos instrumentos mais encontrados no laboratório. Nesta técnica, a fase móvel é um líquido.
Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC)
A cromatografia líquida de alta pressão, agora conhecida como cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), é uma técnica cromatográfica utilizada para identificar, quantificar, separar e purificar compostos individuais presentes numa mistura [1].
Como funciona a cromatografia líquida de alto desempenho?
Na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), a mistura da amostra é passada, juntamente com um solvente líquido sob alta pressão, através de uma coluna preenchida com um material adsorvente sólido. A pressão dentro do sistema é obtida com a ajuda de bombas. O princípio de funcionamento é que cada composto na mistura interage de modo ligeiramente diferente com o material adsorvente na coluna, do qual resultam taxas de fluxo variáveis para os diferentes componentes. Isto leva à separação dos componentes à medida que fluem para fora da coluna. O material adsorvente utilizado é tipicamente granular, constituído por partículas sólidas, tais como sílica, constituindo a "fase estacionária". O líquido pressurizado é uma mistura de solventes, tais como água, e líquidos orgânicos, tais como metanol e acetonitrila, que constituem a "fase móvel".
O detetor é ligado a um microprocessador digital e software de utilizador para aquisição e análise de dados. Os compostos separados são visualizados como picos, sendo o número de picos correspondente ao número de componentes separados na mistura. A área do pico é proporcional à concentração do composto presente na mistura [2]. A resolução entre dois picos nas técnicas cromatográficas é a dimensão até à qual as substâncias são separadas durante a experiência. Maior resolução reflete uma boa separação dos compostos.
Para o que é utilizada a cromatografia líquida de alta resolução?
A cromatografia líquida de alto desempenho tem uma ampla variedade de aplicações nas áreas da bioquímica, química analítica, farmacêutica, forense, pesquisa de alimentos e outras. Por exemplo, a HPLC também é utilizada no ensaio de substâncias proibidas em atletas.
Por que usaria cromatografia líquida de alto desempenho?
A HPLC é acessível e adaptável. Proporciona benefícios úteis, tais como a gestão de dados e a validação de instrumentos.
Cromatografia líquida de ultra alto desempenho (UHPLC)
A cromatografia líquida de ultra alto desempenho (UHPLC) é uma variante da HPLC que utiliza partículas menores para melhorar o desempenho cromatográfico e requer pressões mais altas. De forma semelhante à HPLC, os contaminantes da água podem impactar negativamente nos resultados. No entanto, devido às sensibilidades mais altas da UHPLC, isto pode ser mais extremo.
Tanto a HPLC como a UHPLC podem ser usadas para cromatografia líquida, mas o equipamento necessário para executar ambas difere e cada uma tem benefícios diferentes. O comprimento mais curto da coluna significa que a cromatografia líquida de ultra alto desempenho fornece uma resolução melhor do que a HPLC tradicional.
Cromatografia iónica
A cromatografia iónica permite a separação de iões e moléculas polares com base na sua interação com uma coluna de meios de troca iónica. Pode ser usada para quase qualquer tipo de molécula carregada, incluindo proteínas grandes, nucleotídeos pequenos e aminoácidos. É amplamente utilizada para a determinação de cátions e aniões inorgânicos e orgânicos.
A qualidade da água reagente afeta quase todos os aspetos da análise por HPLC, desde a amostra e a preparação padrão até ao enxaguamento e a eluição da coluna. Isto também torna a água o reagente mais consumido na HPLC.
A água pura (Tipo II) é tipicamente usada para preparar brancas, padrões, eluentes e para o pré-tratamento da amostra; no entanto, como a HPLC gradiente é capaz de limites de deteção extremamente baixos, a necessidade de água é mais rigorosa e a mais alta qualidade é necessária.
Uma grande proporção dos problemas de desempenho da HPLC são devidos à má qualidade da água utilizada na preparação de eluentes, padrões e amostras de HPLC. Água de má qualidade ou contaminada afeta a resolução através da introdução de picos fantasma, alterando a seletividade de fase estacionária e impactando as linhas de base durante a separação cromatográfica.
Além disso, pode levar ao acúmulo de contaminantes na fase estacionária, o que pode causar o bloqueio da coluna. Isto resulta num aumento da pressão e mudança no tempo de execução da amostra. Dados de baixa qualidade, tais como mudança de tempos de retenção, perda de resolução ou picos fantasma, podem ser uma indicação de contaminação causada por orgânicos, iões, bactérias ou partículas.
Quais são os diferentes tipos de contaminantes na água que afetam os resultados da HPLC?
1. Orgânicos
A contaminação orgânica da água ultrapura pode afetar a separação cromatográfica de diferentes maneiras:
(i) Redução da vida da coluna - Moléculas orgânicas que se ligam à superfície da coluna podem retardar o acesso de moléculas da amostra e solvente aos sítios de ligação dentro dos grânulos da coluna (fase estacionária). Daí resulta uma diminuição na capacidade da coluna de separar compostos ou perda de resolução e uma vida útil mais curta da coluna.
(ii) Sensibilidade reduzida - Moléculas orgânicas na água eluente podem competir com moléculas da amostra para ligação aos grânulos da coluna (fase estacionária). Isto diminui o número de moléculas da amostra que se ligam à coluna, reduzindo como consequência o número de moléculas libertadas durante o processo de eluição.
(iii) Dados imprecisos - Picos contaminantes ou fantasma podem ser obtidos a partir de produtos orgânicos que podem acumular-se no topo da coluna e, posteriormente, ser recolhidos como eluato.
(iv) Mudança no tempo de retenção - Altos níveis de orgânicos podem criar uma nova fase estacionária na coluna, o que pode causar uma mudança no tempo de retenção e nos resíduos do pico. Também pode levar a um aumento da contrapressão.
É, portanto, fundamental monitorizar com precisão o nível de orgânicos na água usada para aplicações de HPLC. O carbono orgânico total (TOC) mede as espécies orgânicas totais presentes na água. O TOC é medido em unidades de partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb). Os orgânicos, presentes em ppb elevado, podem alterar a identificação espectral de componentes vestigiais dentro da mistura e influenciar a quantificação do pico.
Um sistema de HPLC pode ser contaminado por uma grande variedade de fontes de TOC. Estas incluem água, lixiviação de meios de purificação, tubos e recipientes, contaminação bacteriana e, potencialmente, absorção da atmosfera. Na verdade, recomenda-se agora evitar o uso de água engarrafada de alta pureza, que não seja acabada de purificar. Isto deve-se ao facto de a água engarrafada por HPLC, que se encontra num ambiente de laboratório há mais de 8 h (exposição a produtos orgânicos atmosféricos) ou água destilada, ser suscetível a um aumento dos níveis de TOC.
Fig 1: Comparison of the TOC levels in HPLC-grade water and Ultrapure water.
A Figura 1 compara a saída de cromatograma de água de grau HPLC e água ultrapura medida em comprimentos de onda de 254 nm e 214 nm. A água de grau HPLC tem níveis mais elevados de TOC, que eluem para fora da coluna causando mudanças na linha de base, com picos com tamanho e número aumentados, em comparação com a água ultrapura [2].
Portanto, o uso de água pura é fundamental para a análise por HPLC, e é importante manter a água livre de todos os tipos de contaminantes. Os cromatógrafos, para além de garantirem a pureza dos solventes orgânicos, das normas e de outros componentes da fase móvel HPLC, devem também assegurar que a água do reagente é de elevada qualidade e desprovida de quaisquer contaminantes.
2. Partículas e colóides
A presença de partículas e colóides na amostra de água pode causar danos na bomba e no injetor, além de bloquear fisicamente a coluna. Aqueles também podem comportar-se como uma fase sólida dentro da ligação da coluna aos constituintes da amostra. Os colóides também podem adsorver irreversivelmente o material de embalagem da coluna, impedindo assim que os constituintes da amostra se liguem à coluna.
3. Iões
A presença de iões no solvente também pode afetar separações cromatográficas. A presença de quaisquer iões absorventes de UV, tais como nitratos, nitritos, sulfatos, brometos, cloretos e fluoretos, pode passar através da coluna e aparecer como um pico no cromatograma, dificultando a leitura dos dados.
Entre os diferentes contaminantes da água que afetam a análise por HPLC, os orgânicos são de longe os determinantes mais importantes para a pureza da água. Evidências experimentais sugerem fortemente que a água ultrapura acabada de preparar deve ser a escolha para qualquer HPLC, pois outras fontes de água, nomeadamente água destilada ou mesmo água engarrafada de grau HPLC, contêm ainda quantidades relativamente altas de orgânicos, o que pode comprometer a qualidade dos cromatogramas e o desempenho do aparelho (ver Figura 1).
Por conseguinte, é imperativo garantir a utilização de sistemas de purificação de água de alto padrão e a manutenção adequada do próprio sistema.
Medição da água
Certifique-se de que está a utilizar o tipo de água certo para a sua aplicação. Eis os requisitos para aplicações de cromatografia líquida:
| É necessária sensibilidade | Resistividade (MΩ.cm)* | TOC (ppb) | Filtro (µm) | Bactérias (UFC/ml) | Endotoxinas (EU/ml) | Nucleases | Qualidade da água |
| Cromatografia iónica | Qualidade elevada geral | >5 18,2 | < 50 <10 | < 0,2 < 0,2 | <10 <1 | NA NA | NA NA | Água de laboratório em geral Água ultrapura (Tipo 1) |
| HPLC | Qualidade elevada geral | >1 >18 | < 50 <3 | < 0,2 < 0,2 | <1 <1 | NA NA | NA NA | Água de laboratório em geral Água ultrapura (Tipo 1) |
Como é que a ELGA Veolia resolve os problemas de pureza da água para HPLC?
Existem diferentes sistemas de purificação atualmente disponíveis, tendo cada método o seu próprio conjunto de vantagens e limitações. A experiência da ELGA em sistemas de purificação de água tem uma reputação de longa data. A ELGA classificou a pureza da água em diferentes graus, o que pode ajudar a determinar o nível de pureza da água necessário para uma determinada aplicação. Por exemplo, o nosso sistema de pesquisa analítica PURELAB ® Chorus 1fornece água ultrapura tipo I com níveis de TOC tão baixos como 2 ppb, o que é extremamente adequado para experiências de HPLC. A ELGA fornece sistemas de purificação de água fáceis de usar, de baixo custo e de baixa manutenção.
Conclusões
A pureza da água como reagente de laboratório é crucial para experiências bem sucedidas. Tecnologias altamente sensíveis, como a HPLC, exigem água de pureza muito elevada, o que significa que a água utilizada deve ter níveis mínimos de TOC e ser desprovida de quaisquer outros contaminantes. A água ultrapura acabada de preparar é a opção para experiências de HPLC e a ampla gama de sistemas de purificação de água da ELGA ajuda os investigadores a garantirem globalmente que a água usada nas suas experiências seja da pureza desejada.
Referências:
[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development. Pharm Anal Acta 2012;3. doi:10.4172/2153-2435.1000147.
[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography: A short review. J Glob Pharma Technol 2010;2:22–6.
