High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Was ist Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)?
Mithilfe von HPLC können die Bestandteile einer Verbindung getrennt werden. Sie können feststellen, wie viel von jeder Verbindung in der Mischung enthalten ist, und Sie können die einzelnen Verbindungen identifizieren.
HPLC ist die Methode der Wahl für die Analyse einer Vielzahl organischer Verbindungen. Flüchtige Verbindungen (VOCs und SVOCs) lassen sich üblicherweise am besten mittels GC oder GC-MS analysieren, HPLC eignet sich jedoch für eine viel größere Vielfalt an Gemischen, einschließlich nichtflüchtiger oder thermisch instabiler Moleküle. Zu den Vorteilen zählen Vielseitigkeit, Empfindlichkeit und die Anwendbarkeit auf sehr komplexe Gemische.
Was ist der Unterschied zwischen HPLC und liquid chromatography?
Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ist im Vergleich zur herkömmlichen Flüssigchromatographie ein schnellerer Prozess, da
Wie funktioniert HPLC?
Die Trennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie basiert auf der Affinität der verschiedenen Verbindungen im Analyten zur mobilen Phase (Eluent) und zur stationären Phase. Die spezifischen intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen einer Probenkomponente und dem Füllmaterial führen dazu, dass diese Moleküle vorübergehend in die stationäre Phase aufgenommen werden.
Je stärker die Wechselwirkung mit der stationären Phase im Vergleich zur mobilen Phase ist, desto länger ist die Wechselwirkung mit der stationären Phase, desto länger ist die Verweildauer auf der Säule und desto länger ist die Retentionszeit (Rf) dieser Komponente. Die Stärke dieser Technik liegt in der großen Auswahl an mobilen und stationären Phasen, die zur Feinabstimmung der Trennungen eingesetzt werden können.
Welche verschiedenen Einsatzmöglichkeiten gibt es für HPLC?
HPLC ist eine weit verbreitete und äußerst leistungsfähige chromatographische Technik mit Anwendungen in Bereichen wie pharmaceutical, bioanalytische, Lebensmittel- und Getränke-, klinische, forensische, Umwelt- und Arzneimittelentwicklungslabore.
Im medizinischen Bereich kann HPLC beispielsweise eingesetzt werden, um den Gehalt und die Konzentration von Substanzen in biologischen Materialien zu bestimmen. Dies könnte Folgendes umfassen: drug analysis des Urins oder Bestimmung des Vitaminspiegels im Blutserum.
Welche verschiedenen HPLC-Typen gibt es?
Normalphasen-HPLC
Bei der Normalphasenchromatographie ist die stationäre Phase unpolar und die mobile Phase polar. Das bedeutet, dass unpolare Substanzen in der Probe schneller eluieren, da sie der mobilen Phase ähnlicher sind und sich schneller bewegen.
Umkehrphasen-HPLC
Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Reversed Phase HPLC) ist das Gegenteil der Normalphasen-Chromatographie. Dabei wird eine polare mobile Phase, wie z. B. Wasser und ein polares organisches Lösungsmittel, zusammen mit einer unpolaren, hydrophoben stationären Phase verwendet.
Die Umkehrphasen-HPLC wird häufig der Normalphasen-HPLC vorgezogen, da die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel die Gefahr einer Verfälschung der Analytretentionszeiten durch Wasseraufnahme aus der Atmosphäre eliminiert. Die Umkehrhochleistungschromatographie gilt zudem als flexibler, da die hydrophobe stationäre Phase in Verbindung mit hydrophoben, hydrophilen, ionischen und ionisierbaren Verbindungen verwendet werden kann, um deren unterschiedliche Bestandteile zu trennen.
Isokratische vs. Gradientenelution
Isokratische Elution bedeutet, dass in der mobilen Phase ein konstanter Gradient aufrechterhalten wird, während sich eine Gradientelution auf ein Experiment bezieht, bei dem die Konzentration der mobilen Phase variiert.
Die Gradientenelution bietet gegenüber der isokratischen Elution mehrere Vorteile, da sie eine gleichmäßigere Verteilung der Peaks mit ähnlicher Breite im gesamten Chromatogramm ermöglicht. Bei der isokratischen Elution weisen die Peaks oft eine geringere Auflösung auf und liegen zu Beginn des Prozesses sehr nah beieinander, werden aber gegen Ende deutlich breiter. Die Gradientenelution kann zudem eine noch kürzere Laufzeit ermöglichen.
Die isokratische Elution wird jedoch häufig der Gradientenelution vorgezogen, da der Gradientenprozess eine größere Sorgfalt und Kontrolle seitens des Bedieners erfordert. Die isokratische Elution erfordert außerdem weniger spezialisierte chromatographische Geräte.
Wie funktioniert pure water Einfluss auf die HPLC?
Die HPLC ist stark von der Wasserreinheit abhängig. Die Verwendung unreiner Wasserquellen zur Herstellung von Eluenten, Blindproben, Proben und Standards kann zu Verunreinigungen im Experiment führen und die chromatographische Leistung durch Beeinträchtigung von Auflösung, Integration und Basislinien beeinträchtigen. Da Wasser das in der HPLC am häufigsten verwendete Reagenz ist, ist es wichtig, dass das gewählte Wasser die für die Empfindlichkeit der Anwendung erforderliche Reinheit aufweist.
Total Organic Carbon (TOC) ist ein wichtiger Messwert zur Beurteilung der Sauberkeit des in der HPLC verwendeten Wassers und hilft Laboren bei der Überwachung auf organische Verunreinigungen, die empfindliche Analysen beeinträchtigen könnten.
Welche Wasserart sollten Sie verwenden?
Für HPLC-Experimente mit allgemeiner Empfindlichkeit empfehlen wir Wasser vom Typ II+. Bei hoher Empfindlichkeit der Anwendung Ultrapure Es sollte Wasser vom Typ I+ verwendet werden, da es einen spezifischen Widerstand von über 18 MΩ.cm, einen TOC-Wert von weniger als 2 ppb, weniger als 1 KBE/ml Bakterien und weniger als 0,03 Endotoxine aufweist.
Instrumentierung
Pumps:
Handelt es sich bei der HPLC um ein Gradientensystem, steht entweder ein Niederdruckgradienten- (LPG) oder ein Hochdruckgradienten- (HPG) Verfahren zur Verfügung. Bei HPG werden die Lösungsmittel auf der Druckseite gemischt und von einzelnen Pumpen zugeführt. Bei LPG hingegen werden die Lösungsmittel auf der Saugseite gemischt.
Spalte:
Die Säule ist das Herzstück jedes HPLC-Systems, da sie für die Trennung der Probenverbindungen verantwortlich ist. Je nach den Anforderungen Ihres Experiments stehen verschiedene HPLC-Säulen zur Verfügung. Beispielsweise kann die Säule mit verschiedenen Füllmaterialien gefüllt werden, um die verschiedenen HPLC-Typen, wie Umkehrphasen- oder Normalphasen-HPLC, zu unterstützen.
Detektor:
Der Detektor misst die Zeit und Menge jeder Substanz, die aus der Säule eluiert wird. Die im Verlauf des Prozesses auftretenden Unterschiede in der Zusammensetzung werden vom Detektor registriert und in ein elektrisches Signal umgewandelt, aus dem ein Chromatogramm erstellt wird.
Chromatographische Parameter
Während des chromatographischen Prozesses erzeugt der Detektor elektronische Signale, die von einem Computer in ein Chromatogramm umgewandelt werden können. Anhand dieser Diagramme lassen sich die in der Probe vorhandenen Substanzen und ihre Mengen bestimmen. Jeder Signalpeak repräsentiert einen Analyten, der von einer mobilen Phase durch die Säule transportiert wurde.
Aus diesen Peaks lassen sich zahlreiche qualitative Informationen gewinnen, vom Zeitpunkt des Peaks bis zur Konzentration der Substanz (dargestellt durch die Fläche unter dem Diagramm).
Es ist auch wichtig, die Auflösung des Prozesses zu berücksichtigen. Ein Auflösungswert von 1,5 oder höher zwischen zwei Peaks bedeutet, dass die Probenkomponenten so weit voneinander getrennt sind, dass Höhe und Breite der Peaks genau gemessen werden können. Die Auflösung kann mithilfe der Gleichung für die fundamentale Auflösung berechnet werden.
Die in dieser Gleichung berücksichtigten HPLC-Parameter sind der Effizienzfaktor (N), der Retentionsfaktor (Kappa) und der Trennfaktor (Alpha). Anpassungen, wie beispielsweise ein Wechsel des im Experiment verwendeten Lösungsmittels oder eine Änderung der Temperatur, können dann vorgenommen werden, um diese Parameter zu verändern und die Auflösung des Experiments zu verbessern.
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Was ist der Unterschied zwischen HPLC und Flüssigkeitschromatographie:
Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ist im Vergleich zur herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie ein schnelleres Verfahren, da die mobile Phase mit einem höheren Betriebsdruck durch die Säule getrieben wird, was zu schnelleren und effizienteren Trennungen führt. Bei der Flüssigkeitschromatographie wird dieser Prozess in der Regel durch die Schwerkraft durchgeführt.